Leprechaun 外泌体检测实验流程

外泌体（Exosome / 小 EV）样品取 50 µL 加到已做过背景扫描的 Luni 上，室温孵育 16 小时；EV 丰富时可缩短到 1 小时。孵育后按检测内容分流：只测粒径和表面标记走 Section 2，加测货物（Cargo）标记走 Section 3。Section 2 和 Section 3 的清洗和换水都由 Luni Washer 自动完成，最后在 Section 4 干燥后上机扫描。检测慢病毒样品中的 EV 污染，请改用 Leprechaun Lentivirus Assay Protocol。

试剂盒内容与存储

Leprechaun Kit 组件

组件 / 数量 / 4–8 °C / 室温

Lunis:数量 8;4–8 °C ✓

Fluorescently labeled antibodies:数量 25 µL;4–8 °C ✓

Incubation Solution (10X):数量 5 mL;4–8 °C ✓

Blocking Solution:数量 10 mL;4–8 °C ✓

USB flash drive with Luni files:数量 1;室温 ✓

Adhesive plate seals:数量 2;室温 ✓

使用前需将所有溶液恢复至室温。

Cargo Add-on 组件（单独销售）

anti-Syntenin antibody (CF® 555) / 25 µL / 4–8 °C

Solution C:25 µL 5 mL;4–8 °C 4–8 °C

Solution D:25 µL 5 mL;4–8 °C 4–8 °C

Luni Washer 组件（单独销售）

Solution A (10X) / 100 mL / 4–8 °C

Solution B (10X):100 mL 100 mL;4–8 °C 4–8 °C

Luni Washer 24 Well Plate:100 mL 10;4–8 °C 室温

额外所需设备

—去离子水（推荐 Fisher Scientific Catalog# LC267404）或电阻率达 18.2 MΩ·cm 的超纯水
—EMS 风格碳纤维尖头细尖镊子（推荐 Fisher Scientific Catalog# 50-193-0842）

样品与试剂准备

样品准备

细胞培养基样品：Leprechaun 可直接分析细胞培养上清，用去外泌体胎牛血清配制的培养基也可以。孵育前建议离心两次（2500 × g，15 分钟），去除细胞碎片。

纯化样品：纯化样品无需孵育前离心。Leprechaun 不兼容 PEG 纯化的样品。

生物体液样品：Leprechaun Exosome Kits 可检测血浆、血清、脑脊液（CSF）、尿液和唾液中的 EVs。生物体液的采集和储存条件会影响背景水平，所以要先看同型对照。如果同型对照上的颗粒数超过 500，建议用尺寸排阻色谱（SEC）纯化样品（见附录 II）。

外泌体标准品（仅 Exosome Starter Kit 提供）：将冻干标准品重悬于 100 µL 1X Incubation Solution。16 小时孵育稀释 1:50，1 小时孵育稀释 1:5。

使用新样品时必须确定正确的稀释度，推荐稀释见附录 III。

试剂配制

Solution A 和 B：将 100 mL（10X）与 900 mL 去离子水混合。混合液装入标有对应 Solution A 或 B 的清洁 Luni Washer 瓶中。1X 溶液可在 Washer 瓶中室温保存，最多一个月，之后随每月 Washer 清洁更换。

Incubation Solution：将 5 mL Incubation Solution（10X）与 45 mL 去离子水混合在 50 mL 锥形管中。1X Incubation Solution 应储存在 4 °C。

荧光抗体混合物：推荐终浓度 0.01–2.5 µg/mL（在 Blocking Solution 中）。使用试剂盒外抗体时，需自行确定最佳浓度（见附录 IV）。不要使用二抗。新抗体偶联的荧光素须与 Leprechaun 兼容，参考《Leprechaun 荧光通道技术规格》。

非透化对照

Section 3（Cargo 染色）中的透化步骤会增强囊泡内染色。如需非透化对照作比较，在 Section 3 中只把 Solution D 换成 Solution B，其余步骤不变。

Luni 操作

避免触碰 Luni 中心区域，以免损坏表面抗体。始终使用随附的镊子夹取 Luni 边缘。

左：正确，镊子夹取边缘；右：错误，触碰中心区域

Section 1：样品孵育

Luni 必须在开始此程序前完成背景扫描。

如需非透化对照，参考上方"非透化对照"部分。

1.1 从冰箱取出装有 Luni 的 Mylar 袋，等待 15 分钟回温至室温后再打开。
1.2 将 Luni Washer 24 Well Plate 放在无振动的实验台上。
1.3 使用镊子将 Luni 放入孔的中心，确保正确操作： - —每孔仅放一个 Luni - —Luni ID 朝向干燥斜台（ramp） - —装载多个 Luni 时，按行填充，不要按列
1.4 用 1X Incubation Solution 将样品稀释至所需浓度。样品至少需稀释 1:1。使用前让 1X Incubation Solution 回温至室温。推荐稀释见附录 III。
1.5 移取 50 µL 稀释样品到 Luni 上。不要用枪头触碰 Luni，避免产生气泡。
1.6 用粘附板封口膜密封板子，确保气密。室温孵育 16 小时（过夜），放在无振动的实验台上。EV 群体丰富时，孵育时间可缩短至 1 小时。
1.7 仅检测 EV 粒径和表面标记 → 继续 Section 2。
1.8 同时检测 EV 粒径、表面标记和货物标记 → 继续 Section 3。

Section 2：表面标记免疫荧光染色

使用前让所有溶液恢复至室温。

2.1 孵育完成后，揭开封口膜，将板放入 Luni Washer，确保 A1 孔位于左上角、干燥斜台（ramp）在孔的远端边缘。再确认板平放在平台上，合上盖子。
2.2 在 Luni Washer 触摸屏主菜单上选择 Exosome。
2.3 按 First Strip，输入含有 Luni 的第一行编号。
2.4 按 Number of Strips，输入含有 Luni 的总行数。
2.5 按 Start。
2.6 配制荧光抗体混合物：向低吸附管中为每个 Luni 加入 300 µL Blocking Solution。
2.7 向 Blocking Solution 中加入以下抗体（每个 Luni 的量）： - —0.6 µL (1:500) anti-CD9 (CF® 488A) - —0.6 µL (1:500) anti-CD81 (CF® 555) - —0.6 µL (1:500) anti-CD63 (CF® 647) 可用自选抗体替换试剂盒提供的抗体。
2.8 涡旋荧光抗体混合物 5 秒。
2.9 提示时打开盖子，向每个孔中加入 250 µL 荧光抗体混合物。染色 60 分钟。染色完成后 Washer 会自动清洗 Luni 并置换为水。
2.10 完成后合上盖子，按 Continue。
2.11 提示将 Luni 移至干燥斜台时，转到 Section 4 操作。

Section 3：货物和表面标记免疫荧光染色

使用前让所有溶液恢复至室温。

3.1 孵育完成后，揭开封口膜，将板放入 Luni Washer，确保 A1 孔位于左上角、干燥斜台（ramp）在孔的远端边缘。再确认板平放在平台上，合上盖子。
3.2 在 Luni Washer 触摸屏主菜单上选择 Exosome Cargo。
3.3 按 First Strip，输入含有 Luni 的第一行编号。
3.4 按 Number of Strips，输入含有 Luni 的总行数。
3.5 按 Start。
3.6 提示时打开盖子，向每个孔中加入 250 µL Solution C。
3.7 合上盖子，按 Continue。
3.8 提示时打开盖子，向每个孔中加入 250 µL Solution D。
3.9 合上盖子，按 Continue。
3.10 配制荧光抗体混合物：向低吸附管中为每个 Luni 加入 300 µL Blocking Solution。
3.11 向 Blocking Solution 中加入以下抗体（每个 Luni 的量）： - —0.6 µL (1:500) anti-CD9 (CF® 488A) - —1.5 µL (1:200) anti-syntenin (CF® 555) - —0.6 µL (1:500) anti-CD63 (CF® 647) 可用自选抗体替换试剂盒提供的抗体。
3.12 涡旋荧光抗体混合物 5 秒。
3.13 提示时打开盖子，向每个孔中加入 250 µL 荧光抗体混合物。染色 60 分钟。染色完成后 Washer 自动清洗并置换为水。
3.14 完成后合上盖子，按 Continue。
3.15 提示将 Luni 移至干燥斜台时，转到 Section 4 操作。

Section 4：Luni 干燥

4.1 提示时将 Luni 移至干燥斜台。移动过程中，Luni 要始终浸没在液面下。按 Continue。
4.2 程序完成后，取出 Luni 放在吸水垫上，Luni ID 朝上。完全干燥后方可扫描。
4.3 将 Luni 装入 Luni Holder，在 Leprechaun 上扫描。

如不能立即扫描，将 Luni 在 4 °C 下存放于 Mylar 袋中。使用前等待 15 分钟回温至室温再打开袋子。

附录

附录 I：从全血中分离人血浆

使用血浆样品时，需按以下方案纯化以确保与 Leprechaun 兼容。

所需材料：含抗凝剂的真空采血管、移液器、15 mL 锥形管、冻存管、温控离心机（带摇摆转子）。

开始前：使用 4–12 mL 新鲜采集的血液，不要使用冻存血液。预设温控离心机至 19 °C，加速/减速设为中速。

A1-1. 将含新鲜血液的采血管在 19 °C 下 1300 × g 离心 15 分钟。离心后可见三层：血浆（顶层）、白细胞（中层）、红细胞（底层）。
A1-2. 用移液器收集血浆，转移至新的 15 mL 管中。避免吸入白细胞或红细胞。
A1-3. 将分离的血浆在 19 °C 下 5000 × g 离心 20 分钟。离心后管底可见小沉淀。
A1-4. 将血浆分装到冻存管中，−80 °C 保存备用。

附录 II：使用 SEC 纯化血浆中的 EVs

在 Luni 上孵育血浆前，Unchained Labs 推荐使用尺寸排阻色谱（SEC）分离血浆成分和 EVs。

所需材料：70 nm 或 35 nm IZON qEV Single、移液器、附录 I 分离的血浆、1.5 mL 收集管、1X Solution B。

开始前：用 3 mL 1X Solution B 预平衡 qEV Single 柱子 3 次，每次让溶液完全流过后再加下一次。

A2-1. 加入 150 µL 血浆到柱子上，等待完全进入柱子后再继续。
A2-2. 加入 850 µL 1X Solution B，弃去流出液（馏分 1–5）。
A2-3. 加入 200 µL 1X Solution B，收集馏分 6（第一个含 EVs 的馏分）。
A2-4. 加入 200 µL 1X Solution B，收集馏分 7（也含 EVs）。
A2-5. 加入 200 µL 1X Solution B，收集馏分 8（也含 EVs）。
A2-6. 取 50 µL 各馏分单独孵育，或合并馏分 6–8 后取 50 µL 孵育于 Luni 上。

附录 III：样品稀释推荐

使用新样品时需优化稀释倍数。在 Leprechaun Analysis（v2.0 之前为 Exosome Analysis）中查看数据时，任何通道（粒径或荧光）的颗粒计数应低于 5000 以确保在可量化范围内。

稀释合适的样品：颗粒分布均匀，信号清晰

过饱和样品：颗粒过于密集，数据不可量化

样品类型 / 推荐稀释 / 说明

细胞培养上清（未纯化）:推荐稀释 1:2;说明孵育前离心两次 2500 × g，15 分钟。细胞至少 50% 汇合度以确保足够 EV 浓度。推荐使用未纯化样品以避免纯化引入偏差

纯化 EVs:推荐稀释梯度稀释 1:10, 1:100, 1:1000;说明不同纯化技术产出的 EV 浓度差异大，需根据具体方法和来源调整

尿液:推荐稀释 1:3;说明孵育前离心两次 2500 × g，15 分钟。尿液通常不干扰检测。如同型对照有背景，用 SEC 纯化

脑脊液（CSF）:推荐稀释 1:10;说明孵育前离心两次 2500 × g，15 分钟。CSF 通常不干扰检测。如同型对照有背景，用 SEC 纯化

血浆 / 血清:推荐稀释按附录 I/II;说明血浆含有干扰 Luni 的成分。SEC 可分离大部分污染物。推荐使用附录 I 的方案从全血纯化血浆

附录 IV：免疫荧光标记优化

不同来源的 EVs 差异大，免疫荧光染色应针对每种检测单独优化。使用自定义抗体或样品时，Unchained Labs 推荐以下步骤优化抗体浓度。颗粒计数应低于饱和值（通过荧光成像判断）。某些样品或抗体可能还需要优化 Blocking Solution。

A4-1. 将试剂盒提供的抗体替换为自选抗体。在单染实验中测试单个抗体，终浓度范围 0.01–2.5 µg/mL。能产生最大颗粒数的最低浓度即为最佳浓度。

Figure A4.1：单染条件下三种荧光抗体的滴定曲线，x 轴为抗体浓度，y 轴为归一化颗粒数

A4-2. 如果担心空间位阻，将单染的结果与混合抗体的结果做比较。如果混染导致颗粒计数下降，在单抗条件下重新优化浓度，或改用顺序染色。

Figure A4.2：(a) 混染计数与单染一致，可用混合抗体；(b) 混染导致计数下降，需重新优化或改用顺序染色

A4-3. 顺序染色时，先加入混染中计数下降最多的抗体，然后依次加入下降次多和最少的抗体。步骤更多，但可减少抗体之间的空间位阻。

附录 V：Leprechaun Exosome Kits 抗体信息

捕获抗体

靶标 / 克隆 / 描述 / 交叉反应

Human CD9:克隆 HI9a;描述 Mouse, IgG1,κ;交叉反应 Bovine

Human CD81:克隆 JS-81;描述 Mouse, IgG1,κ

Human CD63:克隆 H5C6;描述 Mouse, IgG1,κ

Human CD41a:克隆 HIP8;描述 Mouse, IgG1,κ

Isotype control:克隆 MOPC-21;描述 Mouse, IgG1,κ

Mouse CD81:克隆 Eat-2;描述 Armenian Hamster IgG;交叉反应 Rat

Mouse CD9:克隆 MZ3;描述 Rat IgG2a, κ

Isotype control:克隆 HTK888;描述 Armenian Hamster IgG

Isotype control:克隆 RTK2758;描述 Rat IgG2a, κ

检测抗体