Leprechaun 将粒径检测下限从 ExoView R200 的 50 nm 降至 35 nm。它通过免疫捕获 + 单颗粒干涉成像 + 荧光分析，在无需纯化的条件下对外泌体和更小的细胞外囊泡进行浓度、粒径和表型表征。
复杂样品中存在大量与 EV 尺寸相近的非 EV 纳米颗粒（脂蛋白、蛋白聚集体、牛源 EV 等），它们都可能随 EV 一起被共纯化。NTA 和 TRPS 等常用颗粒表征工具无法区分 EV 和其他颗粒，于是非目标颗粒和真信号一起被计数。EV 本身又很小，因此要在不遗漏关键颗粒的前提下分析样品中的全部 EV，难度更大。
Leprechaun 通过免疫捕获将 EV 从其他颗粒中分离出来，只计数被抗体捕获在芯片上的颗粒。它在单颗粒水平上同时给出囊泡浓度、粒径和表型分析（包括货物检测），无需样品纯化。它在前代产品 ExoView R200 的技术基础上升级，可分析范围从外泌体一直延伸到更小的 exomere。
Figure 1. Leprechaun 仪器
Leprechaun 的 Human Tetraspanin Luni 芯片表面包被了 anti-CD81、anti-CD9 和 anti-CD63 抗体。芯片通过免疫捕获，把粗样品或纯化样品中的 EV 选择性结合到表面上。捕获完成后，Luni Washer 自动清洗，去除非特异性结合颗粒。随后用荧光抗体对 EV 进行反染色，最后由 Washer 干燥芯片。
分析时，Leprechaun 使用单颗粒干涉反射成像（SP-IRIS）测定颗粒粒径，同时用荧光显微镜获取 EV 的表型和货物信息。
本实验使用含内源性 GFP 的 EV 标准品（Sigma-Aldrich），加入荧光标记的 anti-CD81-CF555 确认 tetraspanin 表达。EV 标准品按 1:25 稀释在试剂盒提供的 Incubation Solution 中，在 Luni 芯片上孵育 1 小时。清洗和染色后，在 Leprechaun Exosome Analysis 软件中分析（v2.0 起该软件由 Leprechaun Analysis 取代）。通过共定位分析（colocalization）确定 GFP 标记的 tetraspanin 阳性颗粒数量。
两台仪器均采用单颗粒干涉法（SP-IRIS）测量 Luni 表面上捕获的单个囊泡直径。Luni 的二氧化硅增强表面放大了表面反射光与被捕获 EV 散射光之间的干涉信号，让单个囊泡可以成像。两者检测下限的差别（50 nm 对 35 nm）来自 Leprechaun 升级的光学系统和优化的背景扣除算法。所以 35–50 nm 的颗粒现在也能检测、测径和计数。
两个平台测得的总 EV 浓度如 Figure 2A 所示。这里将 EV 定义为 tetraspanin 阳性、粒径在各平台检测范围内、可能表达或不表达 GFP 的颗粒。两个平台的荧光通道在配置、功率和灵敏度上没有差异，因此测得的 EV 浓度差异不会由荧光检测环节引起。
亚群分析显示，GFP 阳性 EV 的浓度在两个平台之间一致（6.5 × 10⁹ particles/mL），但 GFP 阴性 EV 的比例差异明显。ExoView 检测到的 GFP 阴性 EV 只占全部 CD81+ EV 的 27%，而 Leprechaun 达到 45%（Figure 2B）。
Figure 2. (A) Leprechaun 和 ExoView R200 测定的总 EV 浓度。(B) GFP+ 和 GFP- EV 的浓度对比。n=3，误差棒为 SD，绿色=Leprechaun，蓝色=ExoView R200。
粒径分析进一步揭示了差异的来源：GFP 阳性和 GFP 阴性颗粒具有截然不同的粒径分布特征（Figure 3A & 3B）。两个平台上 GFP 阳性 EV 的平均直径均为 82 nm，而 GFP 阴性 EV 的平均直径低于 60 nm。GFP 阳性 EV 的粒径峰完全落在 ExoView 的 50–200 nm 检测范围内，但 GFP 阴性 EV 中有相当比例低于 50 nm 的下限。
Leprechaun 能检测和测径 50 nm 以下的颗粒，因此可以获得 GFP 阴性亚群完整的均值和众数（Table 1）。根据 Leprechaun 的数据，61% 的 GFP 阴性 EV 小于 50 nm，相当于 3.35 × 10⁹ particles/mL。这解释了两个平台在总 EV 浓度上的差异（Figure 2A）。这个数也接近 ExoView（2.33 × 10⁹）和 Leprechaun（5.50 × 10⁹）之间 GFP 阴性 EV 浓度的差值。
Figure 3. Leprechaun (A) 和 ExoView R200 (B) 上 GFP+ 和 GFP- EV 的粒径分布。绿线=GFP+ EV，蓝线=GFP- EV。
Leprechaun / ExoView R200
Mean (nm):Leprechaun Mode (nm);ExoView R200 Mean (nm);Mode (nm)
GFP+ EVs:Leprechaun 82;ExoView R200 72;82;75
GFP- EVs:Leprechaun 48;ExoView R200 42;58;50
Table 1. Leprechaun 和 ExoView R200 上 GFP+ 和 GFP- 亚群的粒径均值和众数。
对 EV 标准品进行梯度稀释测试，Leprechaun 的浓度读数呈线性响应（Figure 4），R² = 0.998。EV 浓度可以从粗样品或纯化样品中直接测定，检测下限低至 5 × 10⁶ particles/mL（Luni 上孵育 1 小时）。
Figure 4. Leprechaun 上 EV 浓度的线性响应。N=3，均值 ± SD。R² = 0.998。
本实验中，Leprechaun 测到的 GFP 阴性 EV 有 61% 小于 50 nm，这部分囊泡落在 ExoView R200 的检测范围之外。可见 EV 的异质性也体现在粒径上：2018 年 exomere 的发现表明，在粒径谱的低端存在大量此前未被充分关注的囊泡亚群。多数分析工具难以检测和测量 50 nm 以下的生物颗粒，EV 样品的表征因此不完整。
检测下限降到 35 nm 后，EV 浓度、粒径、表面标志物表型和货物检测可以在单颗粒测量中同时完成，样品无需纯化。