170 mg/mL 单抗要升到多少度,粘度才降到 20 cP 以下?

170 mg/mL 单抗要升到多少度, 粘度才降到 20 cP 以下?

两种 170 mg/mL 单抗在 4 °C 下粘度都高于 20 cP 的舒适注射上限:mAb2 升到约 13 °C 就降到这条线以下,mAb1 要到约 28 °C。Honeybun 用 35 µL 样品在 4–45 °C 范围内测定 0.5–150 cP 的粘度,一次最多 10 个样品。

为什么低温粘度测量很重要

在发现和早期开发中,高粘度意味着蛋白分子之间或蛋白与辅料之间存在相互作用。这往往提示存在聚集或变性的稳定性隐患,即使样品储存在 4 °C 也不例外。

到了后期开发阶段,焦点转向可生产性。高粘度溶液容易堵塞膜和管路,导致过滤中材料损失和收率降低。灌装高粘度溶液需要更高的压力,可能损伤剪切敏感的蛋白。皮下自注射的高浓度制剂还需要确定粘度降至舒适注射范围(通常 ≤ 20 cP)时的温度。

这些温度点都要实测,但传统粘度测量方法耗时长、耗样量大、一次只能测一个样品。芯片式方法也是逐个测量。Honeybun 是微量粘度计和流变仪,只需 35 µL(默认模式)或 15 µL(低体积模式),就能在一次性 Bun 耗材中测定最多 10 个样品,温度范围 4–45 °C。低粘度样品(≤ 10 cP)10 个测量点不到一分钟完成,高粘度样品也不超过 10 分钟。动态范围 0.5–150 cP,出厂即已校准。

Figure 1A. Honeybun 微量粘度计和流变仪

Figure 1B. Bun 一次性耗材,最多 10 个样品

实验方法

0%、70%、75%、77% 和 78%(w/w)甘油水溶液在去离子水中配制,室温保存,在 Honeybun 上以默认模式(35 µL)于 4 °C 测量,跨 2 个 Bun 共 20 个重复。

mAb1 和 mAb2(170 mg/mL,10 mM histidine)从 26 mg/mL 储液用 Unagi 浓缩制备。浓度、流体动力学直径和 PDI 在 Stunner 上验证。两种 mAb 在 4 至 40 °C 的 5 个温度点上以默认模式和低体积模式(15 µL)各测量三次重复。结果为平均值 ± 一个标准差。

甘油标准品验证:4 °C 实测 1.56–157.4 cP

Honeybun 在 4 °C 下用 35 µL 样品测了水和 4 种甘油溶液,这组样品的预测粘度为 1.567–150.0 cP。水在 4 °C 的预测粘度为 1.567 cP,Honeybun 测得 1.56 cP。78%(w/w)甘油的预期粘度为 150.0 cP,Honeybun 测得 157.4 cP ± 3.7%。70%、75%、77% 甘油的实测值分别比预期高 8.8%、9.7% 和 10.1%(见下表)。

Figure 2. 水和 70%、75%、77%、78%(w/w)甘油在 4 °C 的粘度(默认模式 20 个重复),对数坐标。

Sample / Target viscosity (cP) / Honeybun viscosity (cP)

Water:Target viscosity (cP) 1.567;Honeybun viscosity (cP) 1.56 ± 0.03

70% (w/w) glycerol:Target viscosity (cP) 58.54;Honeybun viscosity (cP) 63.70 ± 3.0

75% (w/w) glycerol:Target viscosity (cP) 100.0;Honeybun viscosity (cP) 109.74 ± 3.71

77% (w/w) glycerol:Target viscosity (cP) 126.6;Honeybun viscosity (cP) 139.36 ± 5.64

78% (w/w) glycerol:Target viscosity (cP) 150.0;Honeybun viscosity (cP) 157.4 ± 5.8

Table 1. 水和 4 种甘油水溶液在 4 °C 的预测粘度和 Honeybun 测量值(默认模式,平均值 ± SD)。

mAb 粘度的温度依赖性

看完甘油在 4 °C 的读数,接下来看真实的高浓度单抗。注射是否舒适、管路会不会堵、过滤效率高低,都取决于制剂在当时温度下的粘度。Honeybun 的温控从冰箱温度(4 °C)覆盖到 45 °C,可以直接测出制剂在不同温度条件下的粘度变化。

mAb1 和 mAb2(均为 170 mg/mL,10 mM histidine)在 4 至 40 °C 的 5 个温度点上三次重复测量。每个温度下,同一 mAb 在低体积模式和默认模式下的结果在误差范围内重叠(Figure 3)。所有样品的粘度随温度升高而非线性下降,两种 mAb 均呈近似对数关系。10 mM histidine 缓冲液(不含抗体)的粘度在全温度范围内接近水。

在相同配方条件下,mAb1 在每个温度点的粘度均高于 mAb2,表明 mAb1 分子间作用力更强。以 20 cP 作为舒适皮下注射的上限,mAb1 大约在 28 °C 时才降至该阈值以下,mAb2 在约 13 °C 就能达到。

Figure 3. 170 mg/mL mAb1 和 mAb2(10 mM histidine)及缓冲液在 4–40 °C 的粘度,默认和低体积模式各三次重复。

结论

生物制剂的粘度与浓度和温度的关系通常是非线性的,难以预测,只能在实际关心的温度下实测。本例中,浓度和配方都相同,mAb1 却要升到约 28 °C 才低于 20 cP。这样的分子如果走皮下自注射,应在筛选阶段就把它从冰箱温度到室温的粘度测全,再决定是否调整配方。

References