BSA 浓度升到 300 mg/mL 时,25 °C 下粘度为 17.3 cP;温度降到 10 °C,最高升到 30.6 cP。本文用 BSA 和 IgG 两种模型蛋白,在 Honeybun 上测了不同浓度和温度下的粘度,每个样品 35 µL。
粘度在开发的两头都要看。早期筛选中,粘度偏高往往提示分子间存在自相互作用;到了开发后期,粘度高会让过滤和灌装变难,严重时药物无法注射。
可是测粘度既费样品又费时间,所以多数项目拿到的数据都不够。经典方法耗样量大、耗时长,一次只能测一个样品。芯片法只需微升级样品,但芯片昂贵,只能逐个测,还要频繁清洗和校准,芯片也容易堵。
Honeybun 一轮最多测 10 个样品,每个 35 µL,6 分钟内完成。样品加在一次性 Bun 耗材里:移液到 Bun 中,插进仪器,在软件里点几下就开始采集(Figure 2)。Bun 用后即弃,没有芯片要清洗,也就不存在堵塞。
Figure 1A. Honeybun 微量粘度计
Figure 1B. Bun 耗材,最多 10 个样品,35 µL/通道
Figure 2. Honeybun 软件界面:几次点击即可完成实验设置并开始采集数据。
牛血清白蛋白(BSA;Sigma-Aldrich;05470)和牛血 γ-球蛋白(IgG;Sigma-Aldrich;G5009)在 1× PBS(Life Technologies;10010-015)中稀释,8,500 rcf 离心 30 分钟。收集上清液作为储液,4 °C 保存。工作液由储液用 1× PBS 稀释配制。
浓度在 Stunner 上使用 Protein (Turbidity) 应用通过 UV/Vis 确认。医用级粘度标准品(MGVS)2 cP(Paragon Scientific;MGVS20-100)保存于 4 °C,直接使用。异常值通过四分位距法(1.5 × IQR)识别并剔除。
皮下注射的高浓度单抗,粘度决定了能否顺利推注,所以配方开发要在多个浓度下测粘度。这里用 BSA 和 IgG 作模型蛋白,在 PBS 中稀释成浓度梯度:BSA 最高 300 mg/mL,IgG 最高 75 mg/mL,纯 PBS 作为对照,25 °C 测量。
BSA 的粘度从约 1.37 cP 升至 17.3 cP(Figure 3A),而且浓度越高升得越快:曲线前段平缓,到高浓度端陡然抬升。IgG 的浓度范围窄得多,粘度从约 0.91 cP 升至 2.0 cP(Figure 3C)。
每个浓度的粘度都不随剪切速率变化,BSA 约 2,000 至 35,000 1/s(Figure 3B)、IgG 约 2,000 至 37,000 1/s(Figure 3D)。这表明两种蛋白在测试范围内表现为牛顿流体。浓度最高的样品也是如此。
Figure 3. BSA 和 IgG 在 25 °C 不同浓度下的粘度(A, C)及不同剪切速率下的粘度(B, D),三次重复。两种蛋白粘度随浓度升高,且在测试剪切速率范围内表现为牛顿流体。
浓度之外,温度也在改变粘度。注射用样品刚从冰箱取出时的表现,和放到室温后可能完全不同,所以两种温度都要测。Honeybun 带温控,本文实验时温度可低至 10 °C(现行规格为 4–45 °C)。
BSA 和 IgG 在 10、15、20 和 25 °C 四个温度下、多个浓度(BSA 0–300 mg/mL,IgG 0–75 mg/mL)测量,各三次重复。BSA 粘度范围为 1.35 至 30.6 cP(Figure 4A),IgG 为 0.88 至 3.0 cP(Figure 4C)。两种蛋白的粘度均随温度升高而下降(Figure 4B, 4D)。在每个温度下,浓度越高粘度也越高。
Figure 4. BSA 和 IgG 在 10/15/20/25 °C 四个温度下不同浓度的粘度(A, C)及不同温度下的粘度(B, D),三次重复。粘度随温度升高而下降,随浓度升高而增加。0 mg/mL 为纯 PBS 对照。
同一个样品,刚从冰箱取出时的粘度可能远高于室温下的值;只在 25 °C 测,会低估制剂冷藏后的粘度。Honeybun 一次最多测 10 个样品,可以把多个浓度放进同一轮,再在几个温度下各跑一轮,得到完整的浓度—温度粘度图。