AAV9 在 60.6 °C 就开始释放基因组，到 76.3 °C 才聚集。要看清这种先后，得在同一个样品里同时读荧光和 SLS。Aunty 把全光谱荧光、SLS、DLS 和精密温控放在同一块 96 孔石英板上，升温过程中同时读出去折叠、聚集和粒径变化。下面的蛋白和病毒载体数据都出自这块板。
Aunty 将全光谱荧光（内源荧光和外源染料）、SLS 和 ISO 标准兼容的 DLS 集成在同一台仪器中，每分钟读取全部 96 个样品。SBS 标准格式的石英板每孔仅需 8 µL 样品，浓度范围 25 µg/mL 至 300 mg/mL。石英与绝大多数化学体系兼容，密封后可防止蒸发和污染。
温控范围 15–95 °C，升温速率 0.1–10 °C/min。荧光、SLS 和 DLS 可以同时运行，也可以单独或组合运行，按实验目的选。
Figure 1. Aunty 板式稳定性平台
加热蛋白通常会使其去折叠，氨基酸重新排列，色氨酸和酪氨酸残基的内源荧光随之变化。追踪荧光变化可以监测蛋白的构象稳定性并确定熔解温度（Tm），用于排序不同配方、构建体、突变体或偶联物的稳定性。
蛋白在热应力下也倾向于聚集。去折叠和聚集常常相伴发生，但并不总是关联，所以最好在同一样品中同步监测两者。SLS 对聚集的起始很敏感，能在热升温中定出 Tagg，与荧光 Tm 并行读取。
Aunty 的板式筛选对蛋白浓度的灵敏度低至 25 µg/mL，下面这组对比就用到了这个浓度。Trastuzumab 在 PBS 中以 1 mg/mL 和 25 µg/mL 测定，两种浓度的 Tm 相似（71.1 和 70.3 °C），但 25 µg/mL 的 Tagg 低于 1 mg/mL（76 vs 79.1 °C）。1 mg/mL 样品的总 SLS 强度更高，表明虽然高浓度对聚集起始的抵抗力更强，但一旦聚集会形成更大或更多的聚集体。
Figure 2. Trastuzumab（1 mg/mL 蓝色，25 µg/mL 绿色）在 PBS 中从 25 至 95 °C 热升温。荧光 BCM（圆圈，左 y 轴）和 SLS（三角，右 y 轴），每 30 秒采集一次。实线为 Tm，虚线为 Tagg，取两次重复的平均值。
Aunty 的 DLS 覆盖 0.3–1000 nm，聚集蛋白和基因治疗载体都能测。作为参照，多数可溶性蛋白的直径为 1–20 nm，病毒 20–100 nm，纳米颗粒则几乎可以是任意尺寸。粒径偏离预期本身就是信号：小颗粒可能意味着污染、降解或杂质，大颗粒可能是聚集体。
3 种 NIST 聚苯乙烯珠标准品的测定直径分别为 22、102 和 512 nm，均在制造商标称范围内（21–25、90–104 和 503–517 nm）。所有样品的 PDI ≤ 0.1，说明是单分散制剂。
Figure 3. 20 nm（绿色）、100 nm（蓝色）和 500 nm（灰色）NIST 聚苯乙烯珠的相关函数（左）、强度分布（中）和质量分布（右）。25 °C，5×4 s DLS 采集，三次重复的代表性曲线。
热升温中可以同时运行荧光、SLS 和 DLS。三者同时采集时 Tm 是否仍然准确，可以拿标准蛋白和已发表的 DSC 值对照。
NISTmAb 是专门用于评估抗体表征方法性能的标准蛋白。Aunty 测得 1 mg/mL NISTmAb（12.5 mM L-histidine，12.5 mM histidine-HCl，pH 6.0）的 2 个 Tm 为 69.7 和 83.5 °C，与已发表的 DSC 值（69.2 ± 0.07 和 83.1 ± 0.14 °C）相差不超过 0.5 °C。
虽然大多数蛋白在热升温过程中会聚集，但 NISTmAb 的 SLS 强度没有显著增加，表明在此条件下不聚集。SLS 和 DLS 并行采集，可以用正交技术确认这一结果：抗体的流体动力学直径仅在约 80 °C 后增大了约 5 nm，且增大时间点与 Tm2 吻合。蛋白聚集体的尺寸通常在数百纳米级别，所以这几纳米的增大来自蛋白去折叠，而非聚集。
Figure 4A. NISTmAb 荧光 BCM + 一阶导数，内嵌表为 Aunty 与 DSC 的 Tm 对比
Figure 4B. 热升温过程中 z-均直径变化
有些蛋白缺乏荧光残基，或所处的环境会猝灭其内源荧光。这时可以使用 SYPRO Orange 等外源染料。Aunty 的全光谱荧光检测配备 280 nm 和 470 nm 两个激发 LED，兼容多种染料，SLS 和 DLS 与内源荧光或染料荧光均可同时工作。
3 mg/mL bovine IgG 在 PBS 中，仅用内源荧光测得 Tm 为 71.3 °C，Tagg 为 70.8 °C（Figure 5A）。加入 20X SYPRO Orange 后，利用染料荧光在疏水面暴露时的增强信号，测得 Tm 为 71.5 °C，Tagg 为 69.9 °C（Figure 5B）。
Figure 5. 3 mg/mL bovine IgG 在 PBS 中。(A) 仅内源荧光，UV LED。(B) 加入 20X SYPRO Orange，470 nm LED。绿色圆点/SYPRO Orange 荧光（左 y 轴）确定 Tm（绿色竖线），SLS（蓝色三角，右 y 轴）确定 Tagg（蓝色竖线）。
病毒载体在加工过程中承受的应力与其他生物制剂类似，但失败模式不同。除了蛋白去折叠和聚集，核酸载荷从衣壳中释出（基因组释放）也是关键问题。功能性检测需要数天，而 Aunty 的 Capsid stability 应用可以在一小时内完成。通过监测 SYBR Gold 荧光的增强（核酸暴露时信号升高），Aunty 能判断病毒基因组何时从衣壳中释出，检测下限低至 5e11 vg/mL（下面示例用的是 5e12 vg/mL）。
AAV9 在 PBS 中的基因组释放 Tm 为 60.6 °C（基于 SYBR Gold 荧光增强），Tagg 为 76.3 °C（基于 SLS）。Tm 低于 Tagg，表明病毒载体在衣壳蛋白整体破坏和聚集之前就已丢失核酸载荷。Aunty 同时监测荧光和 SLS，自动计算 Tm 和 Tagg。
Figure 6. AAV9（5e12 vg/mL）在 PBS 中加入 20X SYBR Gold，25–95 °C 热升温。SYBR Gold 荧光（蓝色曲线，左 y 轴）确定基因组释放 Tm（蓝色竖线，60.6 °C），SLS（绿色圆点，右 y 轴）确定 Tagg（绿色竖线，76.3 °C）。
kD、B22 和 G22 回答的问题相同：在某个配方里，蛋白分子之间是互相排斥还是吸引，聚集倾向有多大；从低浓度改到高浓度配方时，有没有风险。缓冲液选择、辅料添加、突变引入都会改变答案。Aunty 的 Colloidal stability 应用通过 DLS 和 SLS 同时测定这三个参数。
只需移液一组浓度梯度（建议 5 个浓度，三次重复）即可运行。kD 始终可得；加入缓冲液空白则同时获得 B22；输入分析物分子量后还可获得 G22。
吸引性分子间力使蛋白在浓度增加时扩散变慢，排斥性分子间力则使其扩散变快。kD 正值表示排斥（低聚集风险），负值表示吸引（高聚集风险）。B22（第二维里系数）基于 SLS 的 Debye 图线性回归，正负含义与 kD 相同。kD 和 B22 适用于 ≤ 20 mg/mL 的浓度范围。
Trastuzumab 在 10 mM histidine pH 6 + 80 mg/mL 蔗糖中，25 °C 和 42 °C 下均有较高的正 kD（分别为 14.2 和 17.8），换成 0.9% NaCl 后 kD 变为负值（分别为 −3.3 和 −3.5）。蔗糖配方的 B22 比 NaCl 高约 30 倍，表明蔗糖中排斥力更强，trastuzumab 在 histidine + 蔗糖中的胶体稳定性优于含 NaCl 的配方。
Figure 7. Trastuzumab 浓度梯度（1–10 mg/mL）在 10 mM histidine pH 6 + 蔗糖或 NaCl 中，25 或 42 °C 测定。上图为扩散系数线性回归（kD），下图为 Debye 图（B22），表格为结果汇总。三次重复平均值。
G22（Kirkwood-Buff 积分）是更严格的分子间相互作用参数，通过同时考虑蛋白-溶剂和蛋白-蛋白相互作用，在高浓度下（> 20 mg/mL）比 B22 和 kD 更准确。与 B22/kD 不同，G22 的正负含义相反：负值表示排斥，正值表示吸引。G22 在稀释系列的每个浓度点各有一个离散值。
虽然蔗糖在 histidine 缓冲液中稳定了 trastuzumab，但糖类辅料并不总是最佳选择。另一种 mAb（mAb1）在 NaCl 配方中的 R90/K 与浓度关系图显示，高浓度时曲线趋向平台，表明存在盐的排斥力。G22 值在 NaCl 中随浓度增加从正值（吸引）转为负值（排斥），表明高浓度（如 > 50 mg/mL）下 NaCl 实际上是 mAb1 在 10 mM histidine pH 6 中更好的稳定辅料。
Figure 8. mAb1 浓度梯度（10–200 mg/mL）在 10 mM histidine pH 6 + 蔗糖或 NaCl 中，25 或 42 °C 测定 G22。上图为 R90/K vs 浓度，表格为各浓度点的 G22 值。三次重复平均值。
等温实验有两种跑法。Aunty 的密封板可以将样品在设定温度下保持数小时甚至数天，持续监测荧光、SLS 和 DLS 变化。若不想让仪器全程占用，可以用 Out-of-the-box 应用：样品放在外部培养箱中孵育，定期放入 Aunty 读数，软件自动拼接数据。
精氨酸常作为蛋白配方中的粘度降低剂，但它具有双面性：抑制聚集的同时会促进蛋白去折叠。1 mg/mL bovine IgG 在 PBS 中加入或不加 500 mM 精氨酸，62 °C 恒温 14 小时。含精氨酸的样品荧光变化更快（Figure 9A），表明精氨酸加速了蛋白去折叠。同时，SLS 和 DLS 数据显示，含精氨酸的样品中 SLS 增长和 z-均直径增大均更慢（Figure 9B），说明精氨酸虽然促进了去折叠，但抑制了聚集。
Figure 9A. 荧光 BCM 随时间变化（绿色无精氨酸，蓝色含 500 mM 精氨酸）
Figure 9B. SLS（三角）和 DLS z-均直径（菱形）随时间变化
以上数据都来自同一种全石英 96 孔板，检测模式按实验目的组合。每孔只用 8 µL，所以样品量还很少时，就能对构建体、配方、偶联物或修饰做稳定性排序；病毒载体还能顺带看基因组释放。