B₂₂ 和 kD 怎么测？一组稀释系列，同时拿到两个聚集预警指标

B₂₂ 和 kD 怎么测？一组稀释系列，同时拿到两个聚集预警指标

NISTmAb 在 Stunner 上测得 kD 18.9 mL/g，和文献值相同。kD（扩散相互作用参数，来自 DLS）和 B₂₂（第二维里系数，来自 SLS）是预判胶体稳定性的两个核心指标：正值表示分子间排斥、聚集风险低；负值表示分子间吸引、容易聚集。Stunner 在同一组 2 µL 稀释系列上同时测出两个值，还能用 Homebrew 另行测出缓冲液粘度。方法验证用的是 HEWL 和 NISTmAb 两个标准蛋白。

实验条件

HEWL（鸡蛋清溶菌酶）：10 mM 乙酸缓冲液 pH 4.6，分别含 100 mM 和 400 mM NaCl，浓度 1–11 mg/mL。0.1 µm + 0.02 µm 过滤，三次重复。

NISTmAb（RM 8671）：25 mM His/His-HCl 缓冲液 pH 6，浓度 0.25–6 mg/mL。0.1 µm 过滤，9 次重复。

测量设置：B₂₂ & kD 应用，4 次 DLS 采集 × 5 秒，缓冲液空白。PEG40 作为光散射强度参考标准。

粘度测量：30 nm NIST 聚苯乙烯标准珠加入缓冲液，Homebrew 应用测量。由已知粒径和 DLS 测得的扩散系数，经 Stokes-Einstein 方程反算粘度。

Stunner：UV/Vis 蛋白浓度 + DLS 扩散系数 + SLS 散射强度，同一个 2 µL 样品同时采集。

HEWL：kD 随盐浓度由正转负，低盐排斥、高盐吸引

kD 来自 DLS：把蛋白稀释系列的扩散系数对 UV/Vis 测量的浓度做线性拟合，由斜率求出 kD。正值说明浓度升高时扩散变快（分子间排斥力主导）。负值说明扩散变慢（分子间吸引力主导，容易聚集）。绝对值越大，相互作用越强；接近零则为中性。

HEWL 在低盐（100 mM NaCl）条件下 kD = 3.6 mL/g（文献值 4.2），分子间以排斥为主。高盐（400 mM NaCl）条件下 kD = −4.6 mL/g（文献值 −5.7），排斥力被屏蔽，蛋白倾向于自缔合。实验现象与此一致：400 mM NaCl 的 HEWL 溶液在 4 °C 保存后变浑浊，升温到室温后又变澄清。可见这种吸引是可逆的天然缔合：高浓度 NaCl 屏蔽了分子间的电荷排斥，吸引力于是占了上风。

HEWL 扩散系数 vs 浓度：低盐（绿色，kD = 3.6，文献 4.2）和高盐（蓝色，kD = −4.6，文献 −5.7）。插入表格对比 Stunner 和文献值。

NISTmAb：kD 和 B₂₂ 同时验证

B₂₂（第二维里系数）是蛋白自缔合的热力学参数。Stunner 用 SLS 在多个浓度下测光散射强度，做 Debye 图（Kcr/Rθ vs 浓度）线性回归，由斜率求出 B₂₂。正值表示净排斥力，负值表示净吸引力。B₂₂ 基于静态光散射，kD 基于动态光散射，两者独立测量但 Stunner 在同一组样品上同时算出。

NISTmAb（RM 8671）是 IgG1κ 单抗参考物质，广泛用于分析方法验证。在 25 mM His/His-HCl（pH 6）配方中，Stunner 测得 kD = 18.9 mL/g（文献值 18.9，完全一致）。B₂₂ = 4.6×10⁻⁴ mL·mol/g²（文献值 1.2×10⁻⁴，符号一致、同在 10⁻⁴ 数量级）。两个值都为正，说明这个优化配方下蛋白分子间以排斥为主，胶体稳定性好。

NISTmAb 扩散系数 vs 浓度（A，kD = 18.9，文献 18.9）和 Debye 图（B，B₂₂ = 4.6e-4，文献 1.2e-4）。25 mM His/His-HCl pH 6，9 次重复。

Homebrew 测缓冲液粘度：给 kD 和 B₂₂ 的计算换上实测值

DLS 通过散射光的时间波动算扩散系数，再用含粘度参数的 Stokes-Einstein 方程转化为粒径。如果缓冲液粘度和纯水不同（含盐、含糖的缓冲液通常更黏），不输入正确的粘度值就会影响结果。Homebrew 可以反过来用 DLS 测粘度。把已知粒径的 30 nm NIST 聚苯乙烯标准珠加到缓冲液里，DLS 测扩散系数后反算粘度。粘度随温度变化，下表是 20 °C 的值；套用时要和 kD、B₂₂ 的测量温度对上。

缓冲液:Stunner 粘度 (cP)

100 mM NaCl HEWL 缓冲液:1.16

400 mM NaCl HEWL 缓冲液:1.25

NISTmAb 缓冲液:1.49

20 °C，30 nm NIST 聚苯乙烯标准珠测量。纯水 20 °C 粘度 1.00 cP。NaCl 浓度越高粘度越大。

高级 DLS 分析：每次采集的细节都能看到

Stunner Analysis 的 Advanced DLS 视图可以展开每次采集的相关函数和强度分布。绿色线为平均值，深灰色为纳入的单次采集。浅灰色为被自动离群值剔除的采集，也可以手动选择纳入或排除。每次采集的截距、Z-average 直径、PDI 和散射强度都在底部表格里，用于评估数据质量和可信度。

Advanced DLS 视图：单次采集的相关函数和强度分布（灰色）叠加平均值（绿色）。底部表格列出截距、Z-avg、PDI 和散射强度。自动或手动选择纳入/排除。

用早期的低浓度样品，预判高浓度下的聚集风险

两个标准蛋白的 kD 都和文献值方向一致、量级相同；B₂₂ 的绝对值与文献有差距，符号和数量级仍一致。SLS 的 B₂₂ 在不同实验室和不同标定方法之间本身就有较大变异，所以判断配方时，看方向和数量级比看绝对值更可靠。

早期发现阶段的样品浓度只有约 10 mg/mL，本文 HEWL 和 NISTmAb 的稀释系列也在这个范围内，B₂₂ 和 kD 都能测出。据此可以提前判断哪些配方在后续高浓度阶段可能出问题。DLS 和 SLS 在同一个 2 µL 样品、同一次测量中完成，不需要分开跑。用 Homebrew 测出缓冲液粘度后，kD 和 B₂₂ 的计算可以用实测粘度代替默认值。

References