两种 ADC 的 kD 在两种配方中都低于母体 mAb，NaCl 中差得最多：Kadcyla 为 −21.9，Herceptin 只有 −3.3。这组对比用的是 Herceptin、Kanjinti、Kadcyla 和 Enhertu，分别配在含蔗糖或 NaCl 的组氨酸缓冲液中。kD、B22、Tm、Tagg 和 DLS 粒径都由 Aunty 在同一批样品上测得。
疏水性小分子药物偶联到亲水性氨基酸（半胱氨酸或赖氨酸）上，会增加疏水相互作用，使 ADC 比母体 mAb 更容易去折叠和聚集。所以 ADC 配方优化的一个重点，是找到能减弱这些相互作用的辅料。
筛辅料时，构象和胶体稳定性最好在同一个样品上看。Aunty 把 SLS、DLS 和全光谱荧光放在一台仪器里，每孔只要 8 µL，同一个孔里就能读出构象和胶体参数。整块 96 孔板每分钟读一次，升温过程中荧光、SLS 和 DLS 同步记录。
Figure 1. Aunty 板式稳定性平台
Herceptin、Kanjinti、Kadcyla 和 Enhertu（Evidentic GmbH, Potsdam, Germany）用 Big Tuna 置换至 10 mM 组氨酸缓冲液（pH 6），蛋白浓度 0.5–50 mg/mL。初始和最终浓度、粒径及 PDI 在 Stunner 上四次重复测定。4 种蛋白稀释至 10 mg/mL 后，分别加入 80 mg/mL 蔗糖或 0.9% NaCl。
胶体稳定性：制备浓度梯度（1、2、4、8、10 mg/mL），每孔 8 µL 三次重复加入 Aunty 板。使用"colloidal stability"应用在 25 °C 下以 5×4 s DLS 采集和自动衰减测定 B22 和 kD。
热稳定性：同一批稀释系列样品随后从 25 °C 以 1 °C/min 升温至 95 °C，使用"Tm & Tagg with sizing"应用，自动激发设置。由 Aunty Analysis 从内源荧光 BCM（310–370 nm）的变化确定 Tm，从 SLS 强度倍增确定 Tagg，从 DLS z-均直径增大确定 Tsize。
SYPRO Orange 实验：4 种蛋白在 2 mg/mL 下加入 5X SYPRO Orange，三次重复加入 Aunty 板。Kadcyla 另做 1X 和 10X 浓度对照。以 1 °C/min 从 25 °C 升温至 95 °C，使用"Tm & Tagg with reporter dye"应用。Tm 由 SYPRO Orange 荧光（525–640 nm）信号增高确定。
配方研究先要看聚集倾向，扩散相互作用参数（kD）是筛出可开发性差的样品的有效指标。Aunty 的"colloidal stability"应用通过 DLS 测定蛋白稀释系列的扩散系数，再通过线性拟合计算 kD。kD 负值表示分子间存在吸引相互作用（高聚集风险），正值表示排斥相互作用（低聚集风险）。
蔗糖配方中，4 种分子的扩散系数随浓度增加呈正斜率：更高浓度下扩散更快，意味着排斥性分子间力，聚集倾向低（Figure 2A）。换成 NaCl 后，4 种分子全部变为负斜率，表现为吸引相互作用（Figure 2B）。以曲妥珠单抗为母体的 ADC（Kadcyla 和 Enhertu）在 NaCl 中的吸引效应比 mAb（Herceptin 和 Kanjinti）更强。
Figure 2A. 蔗糖配方中扩散系数 vs 浓度
Figure 2B. NaCl 配方中扩散系数 vs 浓度
与 kD 类似，第二维里系数（B22）正值表示排斥力，负值表示吸引力。两者的解读方向一致，但测量原理不同：B22 基于 SLS，kD 基于 DLS。Aunty 在同一个应用中同时测得两者。
蔗糖配方中 Herceptin、Kanjinti、Kadcyla 的 kD 都是较高的正值，Enhertu 最小（Table 1）。换成 NaCl 后，4 种分子的 kD 都变为负值，但只有 Enhertu 的 B22 也为负。也就是说，蔗糖对所有分子都有稳定作用，对 Enhertu 最弱；NaCl 对 Enhertu 的去稳定作用也最强。两种 ADC 的 kD 均低于两种 mAb，排斥力更弱，高浓度下更容易聚集。B22 大体也是 ADC 更低，例外是 NaCl 中的 Kadcyla：kD 为 −21.9，B22 却是 1.89E-04，比两种 mAb 都高。
Sample / Excipient / kD / B22
Herceptin:Excipient Sucrose;kD 21.6;B22 1.93E-04
Herceptin:Excipient NaCl;kD −3.3;B22 1.20E-05
Kanjinti:Excipient Sucrose;kD 14.2;B22 2.13E-04
Kanjinti:Excipient NaCl;kD −3.3;B22 6.54E-06
Kadcyla:Excipient Sucrose;kD 12.1;B22 1.64E-04
Kadcyla:Excipient NaCl;kD −21.9;B22 1.89E-04
Enhertu:Excipient Sucrose;kD 4.6;B22 1.78E-04
Enhertu:Excipient NaCl;kD −20.4;B22 −2.72E-05
Table 1. 10 mM histidine pH 6 中 Herceptin、Kanjinti、Kadcyla、Enhertu 的 kD 和 B22（含 80 mg/mL 蔗糖或 0.9% NaCl）
室温下测得的聚集倾向只是抗体或 ADC 稳定性的一部分。升温时的去折叠和聚集，能补上室温胶体参数看不到的那部分稳定性，也关系到可生产性和可开发性。去折叠和聚集通常相伴发生，所以必须在同一样品中同步追踪。Aunty 在热升温实验中同步采集内源荧光 BCM 的变化、SLS 强度的增加和 DLS 流体动力学直径的变化，在每个配方中并排监测构象和胶体稳定性。
多数 mAb 去折叠时内源荧光会明显红移，熔解温度对应荧光曲线拐点处的温度。Herceptin 在蔗糖中有 2 个 Tm（71.4 °C 和 82.5 °C），Tagg 为 84 °C（Figure 3A）。换成 NaCl 后 Herceptin 明显去稳定：Tm 降至 68.2 °C，Tagg 降至 76.7 °C（Figure 3B）。DLS 数据显示 NaCl 配方中 Herceptin 不仅更早聚集，聚集体也更大。蔗糖中 z-均直径在 87.2 °C 以上才升至 ~18 nm（基线 10 nm），NaCl 中在 ~77 °C 就达到了同样尺寸。NaCl 中的最大值超过了 Aunty DLS 的 1000 nm 检测上限（Figure 3C）。
Figure 3. 2 mg/mL Herceptin 在 10 mM histidine pH 6 + 蔗糖 (A) 或 NaCl (B) 中的 BCM（左 y 轴）和 SLS（右 y 轴），实线竖线为 Tm，虚线竖线为 Tagg。(C) 同一样品的 DLS z-均直径，点线竖线为 Tsize。
ADC 沿用同一套分析参数和应用即可。Figure 4 用的是 1 mg/mL 的 Kadcyla（Herceptin 为 2 mg/mL），所以这里只比较同一分子在两种配方间的变化。Kadcyla 在蔗糖中的 Tm 为 66.7 和 80.8 °C，Tagg 为 84.1 °C（Figure 4A）。NaCl 中 Tm 降至 63.4 °C，Tagg 降至 73.1 °C（Figure 4B）。Kadcyla 在 NaCl 中的聚集体同样比蔗糖中更大（蔗糖中最大 18 nm，NaCl 中超 1000 nm），Tsize 为 71.1 °C（Figure 4C）。聚集体过大或开始沉淀后，SLS 信号会变得嘈杂并下降。
Figure 4. 1 mg/mL Kadcyla 在蔗糖 (A) 或 NaCl (B) 中的 BCM + SLS，及 DLS z-均直径 (C)。
许多 ADC 小分子载荷在色氨酸和酪氨酸的激发波长范围内发荧光，产生光谱串扰，使基于 BCM 或双波长分析的 Tm 判定变得困难甚至不可能。Enhertu 就是这样的案例。
Aunty 的全光谱荧光检测和 470 nm 第二激发 LED 可以使用 SYPRO Orange 等荧光指示染料。SYPRO Orange 在蛋白去折叠暴露疏水表面时荧光增强，Aunty 据此确定 Tm。
Enhertu 在蔗糖中的内源荧光变化虽然存在，但无法用 BCM 确定 Tm（Figure 5A）。SYPRO Orange 分析则检测到 2 个 Tm：59.2 °C 和 79.3 °C。在 NaCl 中，Enhertu 的内源荧光在加热过程中发生了蓝移。Aunty 能够从中识别出 Tm 为 75.5 °C（接近 SYPRO Orange 的 Tm2 = 77.4 °C），但 Tm1 需要依赖 SYPRO Orange 才能识别（Figure 5B）。NaCl 中 Tm1 比蔗糖低 6.8 °C。所以载荷干扰内源荧光时，样品不用换平台，在同一台仪器上改读 SYPRO Orange 信号就能拿到 Tm。
Figure 5. 2 mg/mL Enhertu 的内源荧光 BCM（左 y 轴，绿色）和 SYPRO Orange 荧光（右 y 轴，黄色），蔗糖 (A) 和 NaCl (B)，竖线为 Tm。
按 Tm 和 Tagg 排序，数值越高越稳定。Herceptin 和 Kanjinti 在两种配方中的 Tm1 和 Tagg 接近（Figure 6）。Kadcyla 在两种配方中的 Tm1 和 Tagg 都低于 mAb，Enhertu 的 Tagg 也更低。Enhertu 的内源荧光无法测定 Tm，所以未纳入 Tm1 对比。所有分子都是蔗糖配方更稳，和胶体参数的结论一致。
Figure 6A. 内源荧光 Tm1 对比
Figure 6B. Tagg 对比
SYPRO Orange 测得的 Tm 通常低于内源荧光 Tm（Figure 7A）。两种方法检测的物理事件不同：SYPRO Orange 看疏水面暴露，内源荧光看色氨酸和酪氨酸微环境变化。所以两者的数值不应直接比较，但样品间的相对稳定性排序通常一致。
Herceptin 和 Kanjinti 的 SYPRO Orange Tm 在两种配方中近似相等，Kadcyla 更低，与内源荧光的趋势相同。Enhertu 在 NaCl 中的 SYPRO Orange Tm1 最低。总体来看，Enhertu 是测试分子中稳定性最差的，但蔗糖对它同样有稳定作用。Kadcyla 在 1X、5X 和 10X SYPRO Orange 浓度下的 Tm 相近，说明染料浓度不太可能影响稳定性结果。
SYPRO Orange 实验中的 Tagg 与内源荧光实验趋势一致：ADC 不如 mAb 稳定，多数分子在蔗糖中比在 NaCl 中更稳定（Figure 7B）。唯一明显的差别在 Enhertu：它在两种配方中的 Tagg 近似相等。但 NaCl 中最终 SLS 强度远高于蔗糖，说明 NaCl 中形成了更大的聚集体。
Figure 7. 2 mg/mL 蛋白 + 5X SYPRO Orange 的 Tm (A) 和 Tagg (B)，NaCl 和蔗糖配方对比。
载荷给 ADC 的稳定性表征带来两个难点：疏水相互作用增加，内源荧光也可能受干扰。综合 Tm、Tagg、kD 和 B22，以曲妥珠单抗为母体的 ADC（Kadcyla 和 Enhertu）比 mAb（Herceptin 和 Kanjinti）稳定性更差，组氨酸 + 蔗糖配方优于含 NaCl 的配方。
单看某个参数会漏判。NaCl 中的 Kadcyla 若只看 B22，会排在两种 mAb 前面；看 kD 和 Tagg，它却是最不稳定的之一。所以筛 ADC 配方时，kD、B22 和 Tm、Tagg 最好从同一批样品一起拿到。载荷干扰内源荧光时，同一板改读 SYPRO Orange 就能补上 Tm。